产品货号：
SY0397
中文名称：
GST标签蛋白纯化预装柱(1mL)
英文名称：
gStar Glutathione 4FF Chromatography Column,1mL
产品规格：
1ml|5×1ml
发货周期：
1～3天
产品价格：
询价
本制品是装填了gStar Glutathione Agarose Resin 4FF的一种中压预装柱，规格1mL，预装柱具有标准接口，可以适配商品化的各类中压色谱系统，如ÄKTA等，方便客户操作。
gStar Glutathione Agarose Resin 4FF是一种GST标签蛋白纯化树脂，可以一步纯化各种表达系统中谷胱甘肽-S-转移酶、谷胱甘肽依赖性蛋白和谷胱甘肽重组衍生物。在结构上，该树脂是以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质，通过12个原子的间隔臂，用化学方法共价结合还原型谷胱甘肽制作而成，具有更高的物理化学特性，可以耐受更高的压力，在相对较高的流速下，实现对目的蛋白的纯化，更适于工业大规模蛋白的纯化。
| 基质 | 高度交联的4%琼脂糖微球 |
| 配体 | 通过12原子间隔臂偶联的谷胱甘肽 |
| 粒径 | 45～165μm |
| 载量 | ＞10mg GST protein/mL基质(40kDa) |
| 最大压力 | 0.3 MPa，3 bar |
| pH稳定范围 | 3-12 |
| 储存缓冲液 | 20%乙醇 |
| 组分 | 1mL | 5×1mL |
| GST标签蛋白纯化预装柱(1mL) | 1mL | 5×1mL |
| 说明书 | 1份 | 1份 |
保存：2～8℃，有效期2年。
- 请勿冷冻保存本制品。
- 所有操作过程中，样本需要在4℃或冰上操作。
- 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
- 本制品仅作科研用途！
- 所用水和Buffer在使用前最好用0.22μm或0.45μm滤膜过滤除菌。
- 结合/洗杂缓冲液：PBS，pH7.4(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.4)
- 洗脱缓冲液：50mM Tris-HCl，10mM还原型谷胱甘肽，pH8.0
注：结合/洗杂缓冲液或者洗脱缓冲液中可加入1～10mM DTT。
注：样品在上样前最好用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，减少杂质以防阻塞柱子。
- 样品纯化(以Akta为例)
- 准备：将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中。再折断下口，将预装柱接到色谱系统中，并旋紧。
- 清洗：3～5倍柱体积去离子水冲洗层析柱中储存液。
- 平衡：用5倍柱体积的结合Buffer平衡层析柱，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。
- 上样：将样品加到平衡好的层析柱中，推荐流速1mL/min，保证目的蛋白与树脂充分接触，提高目的蛋白的回收率，收集流出液，待检测。
注：样品的粘度增加使得即使上样体积很少，也会导致层析柱很大的反压。上样量不要超过柱子的结合能力。大量的样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。 - 洗杂：用10～15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，直到紫外吸收达到一个稳定的基线，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液，待检测。
- 洗脱：用洗脱Buffer采用一步法或线性梯度洗脱。一步洗脱中，通常5倍柱体积洗脱液足够将目的蛋白洗脱下来。也可以用一个小的梯度，例如20倍柱体积或更多，来分离不同结合强度的蛋白质。
- 清洗及保存：依次使用3倍柱体积的结合Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4℃保存，防止填料被细菌污染。
- 准备：将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中。再折断下口，将预装柱接到色谱系统中，并旋紧。
- 检测
将纯化过程中得到的样品(包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等)利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。 - 填料清洗
GST标签蛋白纯化产品可以重复使用而无需再生，但随着非特异结合蛋白的增多和蛋白的聚集，会造成流速和结合载量性能下降，此时需对填料进行清洗。- 去除一些沉淀或变形物质
用2倍柱体积的6M盐酸胍溶液进行清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS，pH7.4清洗。 - 去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质
用3～4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积1% Triton X-100清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS，pH7.4清洗。
- 去除一些沉淀或变形物质
| 问题 | 可能原因 | 推荐解决方案 |
| 柱子反压过高 | 填料被堵塞 | 清洗树脂 |
| 裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上样前最好用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，或离心去除 | ||
| 样品太黏稠 | 样品中含高浓度的核酸，延长破碎时间直至粘度降低，或添加DNaseI (终浓度为5μg/mL)，Mg2+(终浓度1mM)，冰上孵育10～15min | |
| 缓冲液太黏稠 | 有机试剂或蛋白稳定试剂(如甘油等)可能会引起反压增高，降低操作流速 | |
| 洗脱组分中无目的蛋白 | GST标签蛋白变性了 | 使用温和的裂解条件，实验条件以经验为准 |
| 过度的裂解使目的蛋白变性 | ||
| 目的蛋白聚集产生沉淀 | 在细胞裂解前溶液中加入DTT，终浓度为1～10mM | |
| 融合蛋白改变了GST的构象，影响了目的蛋白的结合力 | 测定pGEX中GST的结合力，对载体进行超声处理，检测其结合力。如果载体中GST有很高的亲和力，有可能是改变融合蛋白的构象从而降低了GST标签蛋白的亲和力 | |
| 降低结合温度至4℃，充分清洗 | ||
| 柱子平衡时间太短，目的蛋白不是在pH6.5-pH8.0范围内结合 | 用pH6.5-pH8.0的buffer进行充分的平衡，如PBS | |
| 目的蛋白没有完全洗脱下来 | 洗脱体积太少 | 增加洗脱液体积，减小洗脱流速。 |
| 洗脱液中谷胱甘肽浓度太低 | 增加洗脱液中谷胱甘肽浓度，可尝试用50mM Tris-HCl，20～40mM还原型谷胱甘肽pH8.0洗脱 | |
| 低pH影响洗脱 | 在不增加洗脱液中谷胱甘肽量时，提高洗脱液中pH至pH8～9会有改善 | |
| 增加洗脱液中离子强度，如0.1-0.2M NaCl | ||
| 洗脱液中谷胱甘肽被氧化 | 使用新鲜配制的洗脱液 | |
| 加入DTT | ||
| 非特异性疏水作用影响目的蛋白的溶解和洗脱 | 洗脱液中加入非离子型洗涤剂，如0.1%的Triton X-100或者2%正辛基-β-D-吡喃葡糖苷Tween-20 | |
| 电泳或Western Blot检测中发现多条带 | Mr 70000蛋白与目的蛋白一起纯化下来 | Mr 70000蛋白可能是大肠杆菌基因DnaK的产物，可以在目的蛋白中加入50mM Tris-HCl，2mM ATP，10mM MgSO4，pH7.4在37℃加热10min去除 |
| 可通过ATP-琼脂糖胶或离子交换来去除目的蛋白溶液中的dnaK蛋白 | ||
| GST融合蛋白已经发生降解 | 在裂解液中加入蛋白酶抑制剂，如加入1mM PMSF | |
| 可能是蛋白酶对目的蛋白部分降解造成的，可使用蛋白酶缺陷型宿主菌(如lon-或ompT) | ||
| 细胞破碎过度 | 减少细胞破碎时间，超声前加入溶菌酶(菌液体积的0.1倍10mg/mL溶菌酶，25mM Tris-HCl，pH8.0)，避免发泡导致蛋白酶变性，过度超声破碎增加宿主内源蛋白与GST融合目的蛋白的共纯化。 | |
| 共价共纯化 | 包括促进蛋白正确折叠的分子伴侣的共纯化，如：DnaK(Mr～70000)，DnaJ(Mr～37000)，GrpE(Mr～40000)，GroEL(Mr～57000)，GroES(Mr～10000) | |
| 抗体与E.coli的各种蛋白反应 | 抗体吸附E.coli蛋白：GST-抗体；超声处理去除GST抗体，可以用Western Blot检测 |
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